熒光定量PCR技術常用的兩種分析方法

　　它是在PCR定性技術基礎上發(fā)展起來的核酸定量技術。該技術不僅實現(xiàn)了對DNA模板的定量，而且具有靈敏度高、特異性和可靠性更強、能實現(xiàn)多重反應、自動化程度高、無污染性、具實時性和準確性等特點，目前已廣泛應用于分子生物學研究和醫(yī)學研究等領域。在該技術中，有一個很重要的概念是Ct值。C代表Cycle, t代表threshold, Ct值的含義是：每個反應管內(nèi)的熒光信號到達設定的域值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。研究表明，每個模板的Ct值與該模板的起始拷貝數(shù)的對數(shù)存在線性關系，起始拷貝數(shù)越多，Ct值越小。利用已知起始拷貝數(shù)的標準品可做出標準曲線，其中橫坐標代表起始拷貝數(shù)的對數(shù)，縱坐標代表Ct值。因此，只要獲得未知樣品的Ct值，即可從標準曲線上計算出該樣品的起始拷貝數(shù)。

　　熒光定量pcr常用的兩種方法分別為：熒光染料摻入法和探針法

　　1、熒光染料摻入法

　　熒光染料摻入法原理是：在PCR反應體系中，加入過量熒光染料，熒光染料特異性地摻入DNA雙鏈后，發(fā)射熒光信號，而不摻入鏈中的染料分子不會發(fā)射任何熒光信號，從而保證熒光信號的增加與PCR產(chǎn)物的增加*同步。

　　2、探針法

　　探針法熒光定量pcr原理是：PCR擴增時在加入一對引物的同時加入一個特異性的熒光探針，該探針為一寡核苷酸，兩端分別標記一個報告熒光基團和一個淬滅熒光基團。探針完整時，報告基團發(fā)射的熒光信號被淬滅基團吸收；PCR擴增時，Taq酶的5’-3’外切酶活性將探針酶切降解，使報告熒光基團和淬滅熒光基團分離，從而熒光監(jiān)測系統(tǒng)可接收到熒光信號，即每擴增一條DNA鏈，就有一個熒光分子形成，實現(xiàn)了熒光信號的累積與PCR產(chǎn)物形成同步。